研钵型号(研钵型号及生产厂家)

研钵使用

根据磨矿过程中物料的液体含量，球磨机可分为干式球磨机和湿式球磨机。目前，只有在物料会与水发生闹谈改反应、磨矿的后续选别作业含水率要求高而不能采用湿式球磨机的情况下，才会选择干式球磨机。绝大多数选矿厂都采用湿式球磨机，这是由于湿式球磨机比干式球磨机的磨矿效率高、对矿石含水率要求也低。球磨机的命液判名多以MQ命名，类可分格子型（G）、溢流型（Y）或其他，型号规格为内径×长度，以格子型为例，表示方法为：MQ（球磨机）＋G（类型）+内径×长度。常见的湿式球磨机型号和尺寸介绍湿式格子型球磨机的型号尺寸型号：MQG0909~MQG4560，尺寸范侍厅围：900mm×900mm~4500mm×6000mm。参数表：MQYg型湿式节能溢流型球磨机型号：MQYg0912~MQYg3660，尺寸范围：900mm×1200mm~3600mm×6000mm。部分参数展示（详情）：溢流型球磨机的型号尺寸型号：MQY0918~MQY4561，尺寸范围：900mm×1800mm~4500mm×6100mm.参数表：节能溢流型球磨机的型号尺寸型号：MQYg0912~MQYg3660，尺寸范围：900mm×1200mm~3600mm×6000mm.部分参数展示（详情）：以上仅介绍了选矿厂常用的几种球磨机型号及尺寸介绍。如果想了解更多球磨机相关型号参数，可直联系厂家。

研钵尺寸

按照福建省食品*品监督管理*开展医疗机构制剂室专项整治的工作部署及《医疗机构制剂配制质量管理规范(试行)》的要求，2017年6月26日—7月1日，我*按双随机方案组织了5个检查组分赴厦门大学附属第一医院等3家医疗机构，就制剂室人员、设施设备、物料、卫生、配制管理、质量管理等管理情况进行了专项整治检查。现将专项检查中发现的主要问题通告如下：

1、该制剂室配制的品种及批次较多，制剂室与*检室专业技术人员偏少。

2、制剂室部分人员接受本规范培训效果欠佳。

3、固体制剂车间面积偏小。

4、液体制剂分装间台面与墙壁之间有裂缝；制材制粒粉碎间墙体上有3个普通插座；固体制剂车间烘干间有一台家用分体式空调。5、洁净区内配制内服与外用的纯化水软管未严格区分。

5、洁净区内配制内服与外用的纯化水软管未严格区分。

6、*检室中电导率仪、安捷伦7890AGC无仪器状态标识，部分仪器缺合格标志。

7、成品库中，各成品缺明显的状态标识；电脑管理的台账未按批号进行区分。

8、配制间洁净室及*检洁净室内清洁不同部位的毛巾未进行严格区分；清洁用刷子易产生脱落物；洁净区内已清洁的配液罐及搅拌罐内部有水珠；样品实验室高效过滤器表面大量粉尘。

9、甘安合剂与呋麻滴鼻液的批配制记录中，称量及投料工序缺对特殊*品原料（复方樟脑酊、盐酸麻黄碱）监控记录；肚液散（批号20161215）批配制记录中，粉碎工序与混合工序缺使用的设备名称、型号、编号的记录。部分文件制定前未进行认真核对，部分文字内容有误，如：《氧化锌Ⅱ号洗剂工艺规程》（编号：PR-TS-01-052-01）中，氧化锌处方量有误；《3%薄荷乳膏工艺规程》（编号：PR-TS-01-057-01）所写的处方用量与批准的处方用量不同。

10、成品检验原始记录存在较多缺陷，如：3%薄荷乳膏（批号170506）薄层鉴别缺原始图谱，装量原始记录不完整，数据不原始；依沙吖啶溶液（批号170519）含量测定中，依沙吖啶乳酸盐对照品未恒重，未使用相适应的电子天平；紫外分光光度法缺原始图谱；*检室未按规范使用预检定的滴定管；部分制剂未按规范进行微生物限度检测。

1、制剂配制人员、*检人员接受本规范培训效果不佳。

2、洁净区洗手池的下水管封闭不严。

3、洁净区内的温湿度计、压力表、压差计无检定的标识；玻璃器皿自检记录不完整。

4、*检室仪器使用记录不完整，如pH计使用记录中，无样品的批号。

5、标签发放记录中，发放人员未签名。

6、固体物料与液体物料未合理分区存放，可能造成交叉污染。

7、已清洁的不锈钢配制桶内有少量残留水。

8、已消毒的洁净服没有包装，没有标明有效期。

9、文件缺生效及执行日期；已过时的文件，如：蒸馏水器使用操作规程（编码：SOP-M015）未及时销毁；文件未及时更新，多数技术标准中，工艺用水仍写为“蒸馏水”；2015年度配制记录和检验记录未按规定保存2年备查。

10、制剂规程中无不合格品的处置程序及监督措施。

11、制剂室规章制度中，半成品的内控标准及检验操作规程不完整；无培养基管理方法；洁净区的微生物数未按规章制度进行检测。检验原始记录存在缺陷，如：炉甘石硫洗剂（批号：20170601）装量检测错误；硼酸溶液(批号：20170601)含量测定计算错误；复方氯霉素洗剂（批号：20170601）pH值测定错误；曲安缩松乳膏（批号：20170501）装量检测取样错误。

1、原辅料库、包材库面积较小，不能分类、分区、离墙存放，较拥挤。

2、2016年度《空气洁净度检测报告书》（报告编号：201645）部分项目不符合规范要求，如内服配制间、内服分装间换气次数不符合规范要求（只达12次）；化糖间0.5微米的悬浮粒子超标；主要操作间的照度均达不到300Lx，未采取相应的整改措施。

3、外墙进入化糖间的蒸气管道与墙壁连接部位未密封。

4、微生物限度检查缺少相应的阳性对照间。

5、物料无入库验收记录、物料货位卡，部分物料领用记录不规范，物料无法按批号进行追溯。

6、复方樟脑酊、颠茄酊未按要求阴凉储存。

7、内服器具洗涤间使用铁丝球做为器具洗涤工具。

8、配制规程和配制记录中缺少具体的配制参数，如单糖浆配备过程中缺少加热温度、加热时间等参数。

9、未制订原辅料和内包材的检验操作规程；成品检验记录缺性状和装量检查项目。

10、部分管理文件从2006年至今未审核修订。

11、滴定液未按要求进行双人标定。

1、部分人员按《医疗机构制剂配制质量管理规范》培训不到位。2、洁净区内缺少相应的酒剂、搽剂的灌装间，器具和洁具洗涤共用一个功能间；*材净制、炼蜜、炸枯、炼油工序在同一操作间操作；中*饮片烘干使用的HX-20热风循环烘箱位于附属楼五层楼梯口；缺少一般区的更衣区域。

3、中*饮片和制剂成品存放于同一库房；内包材库通风防潮措施不足，现场检查时发现有霉味；

4、洁净区内的干燥间和清洁间内表面不光滑。

5、洁净区内空气洁净度监测未按《洁净区使用、管理和监测制度》执行。2015年度《空气洁净度检测报告书》部分项目不符合规范要求，如总混间、制丸间一、制丸间二、缓冲间换气次数不符合规范要求，主操作间照度达不到300Lx。

6、制水车间位于洁净区内，制水车间与提取车间之间的墙壁存在多处的缝隙。

7、洁净区与一般区的压差达不到10帕。

8、空调净化系统新风采集室内风，部分新风过滤后进入初效前段，部分新风与回风混合后直接进入中效前段，初效、中效两端未安装压差装置。

9、纯化水采取二级反渗透制备，但缺少一级反渗透水储罐。

10、微生物限度检查缺少相应的阳性对照间。

11、物料无入库验收记录、物料货位卡；伤科搽剂和正骨活络油未按阴凉条件储存；贮存于内包材中转间的空心胶囊无标识，从2016年12月2日使用完后一直放置于内包材中转间。

12、胶囊填充机清洁不彻底，有残留的空心胶囊；胶囊填充间高效口有残留*物粉尘。

13、《生产操作规程》中散剂品种的工艺流程与《福建省医院制剂配制规程》不一致，在低温间歇灭菌工序前增加了一道烘干工序。

14、竭七胶囊配制中三七净制后无称量记录。

15、该制剂室无相关的自检记录。

1、制水岗位操作人员操作技能培训效果不佳。

2、洁净室内个别功能间现场发现有蚊子；中*饮片仓库门缝较大，防止昆虫和其他动物进入措施不足。

3、内服器具洗涤存放间水池与地面接口出现开裂；洁具洗涤存放间地面有霉迹。

4、未配置鲜金线莲榨汁设备。

5、部分已停用设备未及时搬出生产场所，如：DTQ新型自控多功能中*提取器、多功能无级调程自动泡罩包装机等；中*提取车间用于提取液过滤的筛网已破损，未及时更换；中*提取车间的蒸汽输送管道部分保温材料脱落，裸露部位金属材料生锈腐蚀较为严重，存在安全隐患。

6、未建立物料台账；物料采用货位卡管理，但已使用完的物料货位卡未归档，无法对物料进行追溯。

7、未规定鲜金线莲及鲜金线莲汁、中*提取液的储存条件及储存期限。

8、降酶灵胶囊标签、说明书中功能与主治未按省*新颁布实施的医疗机构制剂规程相应内容及时更新。

9、现场未能提供洁净室地漏定期消毒记录，地漏液封出现混浊及颜色发黑的情况，个别地漏有蟑螂出没。

10、抗纤I号片配制操作规程制定内容不完整，未制定相关操作工序的技术参数，可操作性不强。）

11、现场使用的《YG．10B易拉瓶自动灌装机操作规程》无制定、审查和批准人的签名。

12、磨粉设备清场不彻底，现场发现设备内部有残留物；YG10B易拉瓶自动灌装机灌装部位（含玻璃活塞、硅胶管）清洗不彻底；100万CC热回流提取浓缩回收机组中的提取罐内的管道出口有霉迹。

13、批制剂记录内容不完整，个别配制环节未在批记录中体现。

14、部分制剂用的原辅料未按标准进行检验后使用。

15、自检记录未见评价及改进措施。

1、仓库管理人员及检验人员对本岗位岗位技能培训效果不佳。

2、未单独设置成品库，现场检查时成品存放于外包装间；包材库面积偏小，不能满足生产实际需要。

3、酊剂分装间部分墙面有霉迹。

4、化验室未配置纯化水检验用所需电导率检测仪器。

5、物料货位卡内容不完整，未体现规格、有效期等信息；货位卡未按产品批号分开填制，无法对物料去向进行追溯；包材仓库内用于洗剂、溶液剂内包装的塑料瓶未密封存放；个别物料在仓库内称量发放，如单、双硬脂酸甘油酯。

6、成品存放场所未设置温湿度调控及监测设备，需阴凉储存的薄荷脑、鱼肝油等原料存放场所温度超标（现场温湿度显示装置显示温度为27℃）。

7、复方硫磺洗剂2号标签中主要成分标识有误：把“硫磺”误写成“雷磺”；补骨脂酊标签中“注意事项”项下内容与注册批件不一致。

8、检查发现补骨脂酊、含酚炉甘石洗剂和尿素乳膏未制定中间品检验规程。

9、留样观察室工作制度无文件制定人、复核人及批准人签字及批准日期。

10、检查发现补骨脂酊、含酚炉甘石洗剂和尿素乳膏批检验记录“检查”项未检验；部分制剂用原辅料未按标准检验后使用。

11、2016年自检记录缺问题评价及改进措施。

需要说明问题4项：

1、在省*已发布的“福建省医疗机构制剂规程1-8批品种目录公告”中，涉及该院制剂品种13个。该院未按照文件要求，对涉及的制剂品种进行相关文件（如：制剂规程、检验规程、标签说明书）的修改。

2、酊剂配制间内使用的抽滤装置未配置防爆型电机，存在安全隐患。

3、该院制剂成品及纯化水的微生物限度检验项目委托本院化验室检验。

4、该院部分制剂品种（地塞米松冰片乳膏、复方氢化可的松乳膏、氢松鱼石糊、粘膜溃疡脂、地塞米松磷酸钠乳膏）使用激素类原料配制，与其他制剂品种共用生产设备。

1、制水岗位操作人员及检验人员对本岗位技能培训效果不佳。

2、制剂室现有面积、洁净区功能间与所配制制剂剂型和规模不相适应；制剂室未配备产品阴凉留样场所。

3、制剂配制用95%乙醇存放场所排气扇不能启动，照明设施及其开关无防爆功能；原辅料常温库内设有一厕所，防污染措施不到位。

4、未对洁净室内空气的微生物数和尘粒数开展定期检测。

5、洁净区内灌装间与空调机房出入门加锁关闭，门下部有一回风口与外界直接相通。

6、制剂室现有纯化水制备设备产量不能满足现有制剂配制需要。

7、未制定纯化水制备系统使用、维护、保养管理制度，未定期更换纯水机滤芯。

8、个别物料在仓库内称量发放，如硬脂酸。

9、地塞米松冰片乳膏、硼酸洗剂、炉甘石硫磺洗剂说明书的“适应症”、“用法用量”等内容与省*发布的规程不一致；所有制剂品种的标签、说明书无“本制剂仅限本医疗机构使用”字样。

10、中间品未制定检验操作规程。

11、*检室留样管理规程（文件编号：JYSOP-007-00）对产品留样时间、样品销毁方式制定不科学。

12、对照品、滴定液未制定管理办法；部分原料未按法定标准检验，只进行了部分检验。

13、2017年自检记录缺问题评价及改进措施。

需要说明问题2项：

1、在省*已发布的“福建省医疗机构制剂规程1-8批品种目录公告”中，涉及该院制剂品种11个。该院未按照文件要求，对涉及的制剂品种进行相关文件（如：制剂规程、检验规程、标签说明书）的修改。

2、该院部分制剂品种（地塞米松冰片乳膏、克氯乳膏、曲安缩松乳膏、复方克林霉素搽剂、粘膜溃疡脂、地塞米松新霉素糊）使用激素类原料配制，与其他制剂品种共用生产设备。

主要缺陷为部分原辅料、半成品未开展取样及检验工作。部分仪器不符合物料检验要求，如复方薄荷脑滴鼻液成品的樟脑鉴别所用的紫外分光光度计（型号7520）不能在230nm到350nm波长间进行扫描，不能精确测定吸收值峰值。用于呋麻滴鼻液成品的盐酸麻黄碱含量测定所使用的旋光仪（型号WZM001）不能正常使用。

一般缺陷为

1、纯化水管道上穿洁净室顶部处部分接口不严密，有缝隙；洁净走廊墙壁与地面交界处的部分弧形接口开裂。

2、空气净化系统维护保养不到位，无初中效清洗更换相关记录，空调净化机组间存放大量杂物。

3、不合格品区设置在楼道走廊，未上锁管理。

4、部分配制用设备、容器无清洁状态标识。

5、纯化水管道未标识内容物及流向。

6、部分成品（如水合氯醛）未按要求阴凉储存。

7、外用工具间存放的标准筛清洗不彻底，残留少量白色粉末。

8、50%硫酸镁溶液（批号20170207,批量40000ml）配制记录不完整，缺少分2次配制20000ml，再混合成40000ml的配制过程记录。

9、未制定液体定量灌装机（型号ZYG30ml）的清洁标准操作规程。

主要缺陷为：

部分制剂品种未制定原辅料、半成品的质量标准和检验操作规范。部分原辅料、半成品未开展取样及检验工作。

一般缺陷为:

1、纯化水系统制水设备无状态标识。

2、空气净化系统维护保养不到位，男一更间安装的压差计损坏未及时更换。

3、、物料仓库存放的物料无状态标识，未划分不合格品区。

4、原辅料库和成品库无相关温湿度记录，无降温除湿设备和防虫纱窗，成品库无货位卡并存放无关的杂物。

5、部分配制用设备、容器无清洁状态标识。

6、配制规程内容不够完整，缺部分具体操作步骤和技术参数等内容。配制记录设计内容不完整，配制过程的记录内容不全。

7、检验记录书写不规范，如有效数字使用不规范，含量检测项目未计算相对标准偏差。成品硼酸氧化锌粉（批号170508）检验记录缺干燥失重项目检测的数据。

8、洁具清洗间地漏无消毒液液封，用水管道未标识内容物及流向。

9、部分成品和原辅料（如氯倍他索尿素软膏、鱼肝油）未按要求阴凉储存。

10、FZ-1型半自动乳膏定量灌装机未制定标准清洁操作规程。

主要缺陷为：

部分用于制剂的中*材（如三七）、中*饮片（如当归、炙甘草）未开展取样及检验工作。部分制剂品种（如大黄微粉胶囊）缺直接入*的中*粉末入*前的微生物限度检查。缺部分物料检验所需要仪器设备，如用于复方呋喃西林滴鼻液成品的盐酸麻黄碱含量测定的旋光仪，用于隆力福胶囊成品的三七皂苷R1含量测定的高效液相色谱仪。

一般缺陷为：

1、口服液灌装间墙壁与地面交界处的部分弧形接口开裂；蒸汽管道上穿洁净室顶部处接口不严密，有缝隙；更衣间、收膏间的洗手池表面锈蚀。

2、空气净化系统维护保养不到位，无初中效清洗更换相关记录，空调净化机组间存放大量杂物，男更衣室、女更衣室安装的压差计损坏未及时更换。

3、物料仓库存放的物料无货位卡，未划分不合格品区。

4、中*材三七外包装无产地、批号、采收日期等信息。

5、用于中*饮片粉碎的设备无设备铭牌，无状态标识。

6、调配液罐（型号PYG-200）清洁不彻底，罐内残留少量的液体。

7、九九降压1号胶囊（批号20170606）批记录未记录中*饮片白芍、钩藤粉碎过筛和胶囊填充的过程。

8、中*材及中*饮片洗涤、浸润、提取用水未定期检验。

主要缺陷为

1、制剂室储存物料的库房面积与所配制制剂不匹配。购进的五桶口服液玻璃瓶盖存放于制剂大楼三楼走廊，未严格按照物料购进验收管理规程进行验收，产品外包装无厂家、批号等信息，且无货位卡；合格物料、待验物料及不合格物料未分别存放，且无明显标识，制剂大楼二楼原辅料暂存间内水杨酸等原料货位卡未记录批号；制剂大楼二楼洁净走廊内存放有12筐250ml玻璃瓶及两筐空试剂瓶；标签说明书存放于制剂大楼四楼空调机房内，未按品种、规格专柜（库）存放；

2、*检室未能履行其主要职责：

（1）成品检验微生物限度检查项目未能进行阳性对照试验；

（2）未定期监测洁净室的微生物数和尘粒数；

（3）毒性试剂未建立购进使用台账；

（4）冰箱内存放已配制的胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基等未标注有效期。

一般缺陷为：

1、菌检室空调系统关闭与打开两种状态下，一更与二更压差计指数均为10Pa；

2、*检室未配备电导率仪；

3、容器具存放间内已清洁容器无清洁状态标识；

4、中*制剂配制规程未及时修订，批准日期为2005年，中*材质量标准仍为《中国*典》2005年版；化*制剂配制规程缺少原辅料、中间产品的质量标准、技术参数等，且无文件制定、批准人签名；

5、《紫草油配制规程》（PZ-Sop-65-00）规程规定加热前浸渍半天，紫草油（批号：170325）配制记录浸渍时间为48小时，且未记录浸渍起始、结束时间；

6、主要原辅料来源发生变更时未进行再验证。

主要缺陷为：

1、该院制剂微生物限度检查项目在该院检验科内完成，未对每批制剂及纯化水储罐用水进行微生物限度检验，无法提供样品交接记录，制剂微生物限度检验记录中检验数据的填写及检验人员签名均为制剂室工作人员；需进行微生物限度检查的成品未及时送检，如：复方氯霉素洗剂（批号：20161114）生产日期为2016年11月，微生物限度检验记录中检验日期为2017年4月7日，*品检验合格报告日期为2016年11月14日，制剂于2016年11月放行，但未记录制剂质量审核日期。

一般缺陷为：

1、部分容器具存放于外用原料暂存称量间；

2、内服原料称量间标准砝码已生锈未更换；

3、未根据洁净式空调洗消规程（文件编号：GC-PZ-WS-KT）对空调系统进行清洁保养；

4、原辅料货位卡未记录批号；

5、留样间无温湿度调控设备；

6、配制规程缺少原辅料、中间产品的质量标准、技术参数、包装材料的要求等信息；配制记录内容不全，如：克氯乳膏（批号：170613）未记录有关设备名称与操作记录、称量过程、温度控制参数等，装量差异检查未记录数据；

7、外用制剂1功能间内配液罐(MF-100)清洁不彻底，罐体仍有白色粉末残留；

1、提取车间无防虫措施；

2、工作间未按制剂工序要求合理布*，制粒工序与干燥工序共用功能间，摇摆式颗粒机与热风循环风箱共同放置在干燥间；菌检室与阳性对照检查室未分离，阳性间无传递窗；

3、*剂科中*材仓库（制剂室所用中*材领用处）内荷叶（批号：1608099，浙江华宇*业股份有限公司）直接放置于地面；原*材及中*饮片未严格分区存放，已合格的中*饮片仍存放于待验区；未对原辅料库内存放的甘草流浸膏（批号：160923，福州海王金象中*制*有限公司）退库的数量进行复核；原辅料库内抽检后剩余的250g氧化锌粉（批号：20170101）包装袋敞口存放；水杨酸甲酯货位卡名称未使用*品通用名；

4、配制规程不完善，未体现原辅料、包装材料的质量标准，个别工艺参数未制定，如脉康宁胶囊配制规程（SOP-PZ018-04-01）未规定提取液与粉末混合时间；配制记录内容不完整，如清淤排石颗粒（批号：170404）未记录烘干时间、烘干铺盘厚度、在线装量差异监测数据、熔封温度等，脉康宁胶囊（批号：170102）未记录混合起止时间；

5、椎消突胶囊配制规程（SOP-PZ019-04-01)规定煎煮分为两次，每次1小时，与《福建省食品*品监督管理*关于发布福建省医疗机构制剂规程第三批品种目录的通告》中规定的煎煮分为两次，每次1.5小时不符；

6、锌氧油（批号：170302）配制记录描述为在研钵中研匀，实际操作为在不锈钢盆中搅匀；

7、玫瑰红钠琼脂培养基已过有效期未及时清除；滴定液标定记录未体现复标人操作。

福建省食*监*要求辖区市食品*品监管（市场监督）部门督促相关医疗机构限期整改，同时应继续加强对医疗机构制剂的监督检查。

研钵规格

热泉高温细菌分离培养方法

MethodsforIsolationandCultivationofThermophilesinHotSprings

鲜文东1,2，胡超建2，李文均1,2,*

1生命科学学院，中山大学，广州，广东省；2南方海洋科学与工程广东省实验室（珠海），珠海，广东省

*通讯作者邮箱:liwenjun3@mail.sysu.edu.cn

摘要：热泉的温度、酸碱度及营养构成迥异于普通生境，是极端环境的典型代表。其中蕴藏着丰富的微生物资源，它们在长期适应极端生境过程中形成了独特的代谢方式和多样的物种组成，对生命起源与进化等相关理论研究和生物技术开发都有重要意义。热泉一般为小型流动水体，因而泉水中微生物丰度不高。热泉中的微生物主要存在于沉积物及高温菌席中，故在分离培养时常选取沉积物和菌席为研究对象。为了在实验室条件下高效分离培养高温热泉环境中的微生物，了解高温热泉环境中可培养微生物的多样性，并为后续的新分类单元的鉴定、功能菌株的筛选提供优质的种质资源，本文根据前期经验，系统总结了高温热泉微生物的分离培养、初步鉴定及保藏的一般流程，并推荐了两种分离效果较好的培养基及其培养条件，最后对初学者可能忽视的注意事项进行了总结。本文阐述的方法适用于分离热泉中的可培养高温菌，对挖掘热泉中的微生物资源有一定的借鉴意义。

关键词：热泉，高温菌，分离培养，鉴定，保藏

材料与试剂

1.无菌培养皿

2.涂布棒

3.接种针

4.无菌PCR管

5.10ml注射器

6.15ml玻璃试管

7.各种型号的枪头(20μl，200μl，1ml)

8.250ml和1L锥形瓶

9.0.22μm无菌有机系滤膜

10.酒精灯

11.各种型号的移液枪

12.研钵

13.研磨棒

14.R2Abroth(Coolaber)

15.酵母提取物(OXOID)

16.琼脂(Solarbio)

17.吉兰糖胶(Gelrite)

18.琼脂糖（TsingKe）

19.Chelex(Bio-Rad，SIGMA)

20.2xPCRMix(GenStar)

21.27F和1492R引物(SangonBiotech)

22.ddH2O

23.甘油

24.Tris-HClBuffer

25.EDTA

26.Sodiumpyruvate

27.KH2PO4

28.(NH4)2SO4

29.FeSO4·7H2O

30.MgSO4·7H2O

31.CaCl2·2H2O

32.NaCl

33.MnSO4·4H2O

34.ZnSO4·7H2O

35.Co(NO3)2·6H2O

36.CuSO4·5H2O

37.Na2MoO4·2H2O

38.H3BO3

39.TrisodiurnEDTA

40.Nicotinicacid

41.Thiaminehydrochloride

42.Biotin

43.P-aminobenzoicacid

44.Cobalamin

45.Calciumpantothenate

46.Pyridoxinehydrochloride

47.Folicacid

48.R2A(见溶液配方)

49.02YE(见溶液配方)

50.10%Chelex(见溶液配方)

51.微量盐(见溶液配方)

52.复合维生素(见溶液配方)

53.甘油管(见溶液配方)

54.1xTE缓冲液(见溶液配方)

仪器设备

1.超净工作台(BJ-2CD)

2.全温振荡培养箱(ZQZY-88BN)

3.全自动高压灭菌器(HVA-85)

4.隔水式恒温培养箱(GHP-9270)

5.触摸屏梯度PCR仪(T100)

6.台式高速冷冻离心机(5427R)

7.电热鼓风干燥箱(DHG-9140A)

8.凝胶成像系统(GenoSens1850)

9.无损蓝光投射切胶仪(Ultraslim)

软件和数据库

1.EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)

2.NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

实验步骤

一、事前准备：

1.样品：菌席样品N1个，沉积物样品N2个，共N个

2.稀释梯度：10-1、10-2、10-3、10-4，共M个

3.培养基：共X个（O2YE，R2A）

3.10.02%02YE

3.21/10R2A

4.培养温度：45°C，55°C，65°C，共Y个温度梯度

二、材料准备：

需要提前准备并灭菌的材料和试剂有：

1.锥形瓶N个(250ml)，并加入10粒玻璃珠和45ml纯水

2.接种针

3.纯水1L

4.无菌培养皿N×M×X×Y个

5.1ml和200ml枪头若干

6.涂布器若干

7.15ml玻璃试管(有胶塞)N×M个

8.研钵

9.研磨棒

10.甘油管

11.牛奶管

三、分离培养基配制：

根据培养基配方配制适量培养基，高温灭菌后，待培养基冷却至50°C左右，在超净工作台中调至合适pH(样点pH值)，加入1ml/L的复合维生素，充分混匀，倒入无菌培养皿中，凝胶厚度大于培养皿的1/2，过夜风干培养基表面水分。

四、菌席样品和沉积物样品稀释：

1.首先将菌席样品置于事先灭菌的研钵中研磨1分钟(沉积物不需要研磨)，每个样品称取5g转移到灭菌后含有玻璃珠和45ml纯水的锥形瓶中，制成稀释度为10-1，最后置于37°C摇床以180转/分钟转速震荡混匀1小时，使样品充分分散。

2.准备N×M个15ml玻璃试管，用注射器在所有玻璃试管中加入9ml灭菌后的纯水备用。

3.将振荡完成的样品充分摇匀，用移液枪吸取1ml到玻璃试管中，此时稀释梯度为10-2，充分震荡混合，标记样品名和稀释梯度，依次梯度稀释至10-4，每次吸取前注意充分摇匀。

图1.样品梯度稀释

五、样品涂布及分离培养：

样品稀释完成后，从每个玻璃试管中吸取100μl稀释液到培养皿，用涂布棒充分涂匀，涂布过程中平板距离酒精灯火焰3~5厘米,然后在每个培养皿上做好标签，一般需要包含培养基、样点、培养温度、稀释梯度及涂布时间等信息，在超净工作台中正置2小时，使培养基表面的水分充分吸收，最后倒装入保鲜袋中，分别放入45°C，55°C，65°C培养箱置后培养3~7天。

由于热泉微生物生长在高温条件，为了防止培养基水分蒸发过快，用封口膜包裹平板，并在每个保鲜袋内放置一个开放的、盛满水的培养皿，増加保鲜袋内的空气湿度，减缓培养基水分的蒸发。

图2.样品涂布

六、纯化培养基配制：

培养三天后每天观察分离平板，当分离平板上有少许单菌落出现时，可以提前准备纯化培养基，一般选用原浓度的R2A。培养基配制前需观察分离平板上细菌的丰富度，提前估计待纯化的菌株数量，可准备大于或同等数量的培养皿(单板)，或者半数(二分板)和四分之一数量(四分板)。与配制分离培养基类似，待培养基灭菌后，首先调节pH到所需水平，然后加入复合维生素，过夜干燥后备用。

七、菌株的纯化及保藏：

待分离培养皿上的单菌落清晰饱满后，可开始下一步的纯化。先用记号笔在培养皿的底部标记好待纯化的菌株，并将其按顺序编号。挑选的原则是：单菌落必须与周围菌落存在一定的距离，以避免接种针在挑取过程中误触杂菌。另外，尽量全面挑取不同颜色、大小、透明度、边缘特征及表面特征的菌落以避免重复，但比较小的类似菌落可适当多挑，因为这些菌落可能还未完全分化为成熟的形态。挑选完成后，在超净工作台中利用接种针挑取单菌落到纯化板上，采用三区划线法。接种完成后，对每株菌做好标记，一般为分离培养皿编号加上该平板上计数的菌株编号，总编号最好保持在5位数字/字母内，以减少后期记录过程中出现错误，最后放回原培养箱继续培养。

所有纯化后的菌株，挑选2区和3区菌落悬浮于甘油管(20%，w/v)，-80°C保存，用于短期实验接种和种质保藏。

图3.三区画线法

八、菌株初步鉴定：

1.纯化培养皿培养2~3天后，基本会生长出较为明显的菌落，此时可根据菌株的生长状况进行分批测序鉴定。

2.观察并记录每株菌的生长状况、颜色以及特殊形态(颜色，大小，边缘，透明度等)；

3.挑取适量菌体(一个菌落)到装有50μlChelex溶液(10%)的PCR管中。

4.放入PCR仪器中，99°C加热30min或放入99°C水浴锅加热30min，使细菌细胞壁破裂，释放出DNA。

5.短暂离心使细胞碎片及Chelex沉降到PCR管底部，同时上清液基本澄清，此时细菌遗传物质溶解在上清液中。

6.加入1μl上清液至配制好的PCR体系中，离心混匀，放入PCR仪中，特异性扩增细菌DNA中的16SrRNA基因，50μlPCR体系和PCR扩增程序如表1和2所示。

表1.50μlPCR体系

试剂

用量(μl)

ddH2O

22

2×PCRMIX

25

1492R

1

27F

1

模板/空白对照

1

表2.细菌16SrRNA基因的PCR扩增程序

温度

时长

目的

94°C

4min

预变性

94°C

1min

变性

56°C

30s

退火

72°C

1min30s

延伸

循环32次

72°C

10min

延伸

4°C

∞

保存

7.扩增结果检测：PCR扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳后，在无损蓝光投射切胶仪下回收清晰且片段大小符合(约1500bp)的目标条带，用胶回收试剂盒纯化回收目标条带，并进行16SrRNA基因克隆实验，单克隆产物使用1%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统(GenoSens1850)检测电泳结果，选择条带清晰且片段大小符合(约1500bp)的单克隆样本完成测序，测序结果在EzBioCloud或NCBI数据库上进行比对，可得到最相似菌株，并根据此结果展开后续实验。

九、后续实验参考：

1.16SrRNA基因克隆及进化树构建。

2.新分类单元的多相分类实验：当菌株与现有物种的相似性小于98.65%时(Kimetal.,2014)，可以认为是潜在新种，有必要进一步开展多相分类实验，具体方法可参考IJSEM杂志(https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/ijsem)已发表相关文章。

3.筛选特定功能菌株：将分离平板培养基中的底物替换为羧甲基纤维素钠、微晶纤维素等底物，在高温培养箱中培养，可分离出纤维素降解菌,分离方法和评价标准可参考张靖宜等(2020)的描述。

4.特定类群的代谢产物分析，如热稳定性高温酶研究等。

5.基因组分析。

结果与分析

1.分离效果的评估：

1.1总分离菌株的数量和多样性；

1.2潜在新分类单元的数量及多样性。

2.不同样点、温度和培养基间分离效果的比较。

3.与同一样品的扩增子测序结果比较。

注意事项

1.每天观察培养皿生长情况，注意避免培养皿中琼脂干涸。

2.观察平板时不要直接反转平板，防止培养皿顶部凝结水滴到培养基上，导致菌落间的交叉污染。

3.10%Chelex可以满足大部分细菌16SrRNA基因扩增模板的制备，但个别细菌DNA需要使用小量酶法提取，具体方法可参考Li等(2007)的描述。

溶液配方

1.10%Chelex

将10gChelex溶于90mlTE缓冲液中，121°C高压灭菌25分钟，置于4°C冰箱中保存备用

2.1xTE缓冲液

取5ml1MTris-HClBuffer和1ml0.5MEDTA到500ml烧杯中，搅拌均匀，将PH调整为8,121°C高压灭菌25分钟，室温保存。

3.甘油管的制备

将20ml甘油(丙三醇)加入含有80ml的纯水中，用玻璃棒搅拌混匀，每个甘油管分装0.5~1ml甘油，121°C高压灭菌60min。

4.R2A

R2ABroth0.315g

琼脂粉18g

ddH2O1,000ml

pH根据样点而定

121°C高压灭菌30min

5.02YE

酵母提取物2g

丙酮酸纳1g

KH2PO40.38g

K2HPO40.39g

(NH4)2SO40.5g

复合维生素(溶液配方7)1ml

微量盐5ml

琼脂粉12~18g

ddH2O1,000ml

pH根据样点而定

121°C高压灭菌30min

6.微量盐

FeSO4·7H2O1.11g

MgSO4·7H2O24.65g

CaCl2·2H2O2.94g

NaCI23.4g

MnSO4·4H2O111mg

ZnSO4·7H2O28.8mg

Co(NO3)2·6H2O29.2mg

CuSO4·5H2O25.2mg

Na2MoO4·2H2O24.2mg

H3BO331.0mg

TrisodiurnEDTA4.53g

ddH2O1,000ml

7.复合维生素

Nicotinicacid(烟酸，VB3)100mg

Thiaminehydrochloride(硫胺素，VB1)100mg

Biotin(生物素，V7)5mg

P-aminobenzoicacid(对氨基苯甲酸，VBX)50mg

Cobalamin(钴胺素，VB12)1mg

Calciumpantothenate(泛酸钙，VB5)50mg

Pyridoxinehydrochloride(盐酸吡哆醇，VB6)50mg

Folicacid0.5mg

ddH2O100ml

在超净工作台中用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，配制完成后分装到无菌EP管中，置于4°C冰箱保存备用。

致谢

本文得到国家自然科学基金(91951205)的资助。

参考文献

1.Kim,M.,Oh,H.S.,Park,S.C.andChun,J.(2014).Towardsataxonomiccoherencebetweenaveragenucleotideidentityand16SrRNAgenesequencesimilarityforspeciesdemarcationofprokaryotes. IntJSystEvolMicrobiol64(Pt2):346-351.

2.张靖宜,刘兰,明语真,胡昭钰,邹小娟,刘泽涛,肖敏,李文均.(2020).广东从化温泉水体原核微生物多样性及其酶活筛选.生物资源.42(05):557-567.

3.Li,W.J.,Xu,P.,Schumann,P.,Zhang,Y.Q.,Pukall,R.,Xu,L.H.,Stackebrandt,E.andJiang,C.L.(2007).Georgeniaruaniisp.nov.,anovelactinobacteriumisolatedfromforestsoilinYunnan(China),andemendeddescriptionofthegenusGeorgenia.IntJSystEvolMicrobiol57(Pt7):1424-1428.      

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研钵装置图

规格用口径的大小表示的，40-300mm各种规格。

研钵如何使用

我是管理实验室的，给你一套初中化学仪器设备配备标准吧，有很多

名称规格型号功能

通用

视听

书写投影器250mm×250mm

视频展示台

液晶投影机

银幕

彩色电视机

影碟机

计算机

计算机多媒体

计算机数据采集处理系统开放式软件系统，智能接口，温度、湿度、pH值、溶解氧、光等传感器，在线和离线系统，配套专用实验仪器

一般

钢制黑板900mm×600mm

打孔器四件

打孔夹板

打孔器刮刀

手摇钻孔器

电动钻孔器

仪器车

电动离心机

离心沉淀器手摇式

名称规格型号功能

磁力加热搅拌器

酒精喷灯坐式

电加热器密封式

蒸馏水器

列管式烘干器

烘干箱

注射器10mL，塑料

塑料洗瓶250mL

试剂瓶托盘

实验用品提蓝

塑料水槽250mm×180mm×100mm

碘升华凝华管

支架

方座支架

万能夹

三脚架

泥三角

试管架

漏斗架

滴定台

滴定夹

多用滴管架

电源

名称规格型号功能

学生电源直流：1.5～9V/1.5A，每1.5V一档

教学电源交流：2～12V/5A，每2V一档；直流：1.5～12V/2A，分为1.5V、3V、4.5V、6V、9V、12V，共6档

测量

质量

托盘天平100g，0.1g

托盘天平500g，0.5g

电子天平100g，0.001g

电子天平400g，0.1g

温度

温度计红液，0～100℃

温度计水银，0～200℃

数字测温计-30～+200℃

电

多用电表指针式，普通

其它

密度计密度＞1

密度计密度＜1

酸度计(pH计)笔式，测量范围pH0.0～14.0

专用仪器

名称规格型号功能

化学

水电解演示器

水电解实验器

原电池实验器

贮气装置

初中微型化学实验箱

分子间隔实验器

溶液导电演示器

微型溶液导电实验器

化学实验装置磁性教具磁性橡胶

化学实验废水处理装置实验教学和废水处理兼用

元素学习卡学习元素名称、符号用

安全环保型气体发生器对常用化学实验进行微型封闭化的改造

模型

化学

炼铁高炉模型

初中分子结构模型

金刚石结构模型演示用

石墨结构模型演示用

碳-60结构模型演示用

氯化钠晶体结构模型演示用

碳的同素异形体结构模型包括金刚石、石墨、碳-60三种结构模型；小型，球管式，可拆卸

标本

名称规格型号功能

化学

金属矿物、金属及合金标本各类不少于5种

原油常见馏分标本不少于8种

合成有机高分子材料标本不少于10种

新型无机非金属材料标本氧化铝陶瓷、氮化硅陶瓷、光导纤维等

挂图、软件及资料

化学

教学挂图(图片)

走进化学实验室

身边的化学物质

物质构成的奥秘

化学与社会发展

元素周期表带轴

教学投影片、幻灯片

初中化学教学投影片

中学化学投影拼板

教学VCD、DVD

名称规格型号功能

初中化学教学VCD、DVD盘

多媒体教学软件

初中化学多媒体教学软件

图书、手册

初中化学探究活动汇编配合新课标

初中化学教学仪器使用手册

玻璃仪器

计量

量筒10mL

量筒50mL

量筒100mL

量筒500mL

量杯250mL

容量瓶250mL

容量瓶500mL

滴定管酸式，25mL

滴定管碱式，25mL

加热

试管φ12mm×70mm

试管φ15mm×150mm

试管φ18mm×180mm

名称规格型号功能

试管φ20mm×200mm

试管φ32mm×200mm

具支试管φ20mm×200mm

硬质玻璃管φ15mm×150mm

硬质玻璃管φ20mm×250mm

烧杯25mL

烧杯50mL

烧杯100mL

烧杯250mL

烧杯500mL

烧杯1000mL

烧瓶圆、长，250mL

烧瓶平、长，250mL

锥形瓶100mL

锥形瓶250mL

蒸馏烧瓶250mL

一般

酒精灯150mL

抽滤瓶500mL

抽气管

干燥器160mm

气体发生器250mL

冷凝器直固，300mm

牛角管弯形，φ18mm×150mm

名称规格型号功能

漏斗60mm

漏斗90mm

安全漏斗直形

安全漏斗双球

分液漏斗锥形，100mL

分液漏斗梨形，50mL

布氏漏斗瓷，80mm

T形管

Y形管

滴管

离心管

干燥管单球，150mm

干燥管U型，φ15mm×150mm

活塞直形

圆水槽φ200mm×100mm

圆水槽φ270mm×140mm

玻璃钟罩φ150mm×280mm

容器

集气瓶125mL

集气瓶250mL

液封除毒气集气瓶250mL

广口瓶60mL

广口瓶125mL

广口瓶250mL

名称规格型号功能

广口瓶500mL

广口瓶茶，60mL

广口瓶茶，125mL

广口瓶茶，250mL

细口瓶60mL

细口瓶125mL

细口瓶250mL

细口瓶500mL

细口瓶1000mL

细口瓶3000mL

细口瓶茶，60mL

细口瓶茶，125mL

细口瓶茶，250mL

细口瓶茶，500mL

细口瓶茶，1000mL

滴瓶30mL

滴瓶60mL

滴瓶茶，30mL

滴瓶茶，60mL

材料和配套用品

坩埚瓷，30mL

坩埚钳200mm

烧杯夹

镊子

名称规格型号功能

试管夹

止水皮管夹

螺旋皮管夹

石棉网

燃烧匙

*匙

玻璃管φ5～φ6mm

玻璃管φ7～φ8mm

玻璃棒φ3～φ4mm

玻璃棒φ5～φ6mm

软胶塞

橡胶管

乳胶管

试管刷

烧瓶刷

结晶皿80mm

表面皿60mm

表面皿100mm

研钵瓷，60mm

研钵瓷，90mm

蒸发皿瓷，60mm

蒸发皿瓷，100mm

反应板至少6穴

井穴板9孔，0.7mL×9

井穴板6孔，5mL×6，附带双导气管的井穴塞

名称规格型号功能

塑料多用滴管4mL

*品

一般无机(一)

铝片

铝箔

铝丝

锌粒工业

还原铁粉试剂

铁丝

锡粒

铅粒

紫铜片

铜丝

碘试剂

活性炭

二氧化锰试剂

三氧化二铁试剂

氧化铜工业

氯化钾试剂

氯化钠试剂

氯化钠工业

氯化钙试剂

无水氯化钙工业

氯化镁试剂

三氯化铁试剂

名称规格型号功能

氯化铵工业

碘化钾试剂

硫酸钾试剂

硫酸铝试剂

硫酸铜(蓝矾、胆矾)工业

硫酸铵工业

硫酸铝钾(明矾)工业

无水硫酸铜试剂

一般无机(二)

碳酸钾试剂

碳酸钠工业

碳酸氢钠工业

大理石

碳酸氢铵工业

碱式碳酸铜试剂

硝酸银试剂

乙酸铅试剂

氢氧化钡试剂

氨水试剂

氧化钙(生石灰)

氢氧化钙(熟石灰)

碱石灰

一般有机、指示剂

名称规格型号功能

一般有机

无水乙酸钠试剂

柠檬酸钠试剂

葡萄糖

蔗糖

酒精0.95

煤油

指示剂

石蕊指示剂

酚酞指示剂

品红染料

pH广范围试纸1～14

蓝石蕊试纸

红石蕊试纸

定性滤纸

易燃液体

低闪点易燃液体

汽油

丙酮试剂

中闪点易燃液体

高闪点易燃液体

易燃固体、自燃物品、遇湿易燃物品

名称规格型号功能

易燃固体

红(赤)磷

硫粉工业

镁条

铝粉工业

自燃物品

黄(白)磷

遇湿易燃物品

氧化剂

过氧化氢试剂，30%

氯酸钾工业

高锰酸钾试剂

硝酸铵试剂

硝酸钾试剂

硝酸钠试剂

硝酸汞试剂

硝酸钡试剂

有毒品

草酸试剂

氯化钡试剂

腐蚀品

酸性腐蚀品

硝酸试剂

名称规格型号功能

硫酸试剂

硫酸工业

盐酸试剂

盐酸工业

甲酸试剂

乙酸试剂

碱性腐蚀品

氢氧化钾试剂

氢氧化钠试剂

氢氧化钠工业

其它实验材料和工具

实验材料

初中化学实验材料黄铜片、火柴、蜡烛、剪刀、焊锡、炭棒、导线、电灯泡、木板、电池、电珠、砂纸等

工具

一字螺丝刀

十字螺丝刀

钢丝钳

手锤

锉刀

剪刀

玻璃瓶盖开启器

玻璃管切割器

名称规格型号功能

安全防护用具

工作服防酸碱

护目镜侧面完全遮挡

防护面罩

防毒口罩

耐酸手套

洗眼器

简易急救箱

实验防护屏

易燃品储存柜

毒害品储存柜

自备材料

木炭、植物油、面粉、味精、食醋、洗洁精、铁钉、棉花、牛奶、鸡蛋等

研钵型号及生产厂家

研钵有普通型（浅型）和高型（深型）2种。中学常用瓷质或玻璃研钵，其规格以口径表示，常用60mm和90mm2种。

研钵规格型号

我最近在新建一个化学实验室，我自己列了一张表，你看看是否对你有帮助

实验室需购买的仪器及试剂

1、仪器

样品名称型号规格等级数量单价(元）总价(元）

可见分光光度计1台1450

万分之一电子天平1台2300

0.01电子天平1台340

电导仪DDS-11A型1台450

酸度计PHS-2型1台550

烘箱550

可调电炉800W单联/1000w1台50

铁架台1台32

玻璃底板滴定台1台32

两用滴定管50mlA1支20

称量瓶25mm*40mm3个4

酸式滴定管50mlA1支

大肚移液管50ml1支8

25mL1支7

定量移液管5ml50支/包6支4.5

1ml2支4

锥形瓶250mL3个3.8

100ml3个3

容量瓶500ml1个9.5

250mL2个8

100mL2个5

50ml7个4.5

具塞比色管50ml一套（6支）4

塑料洗瓶500ml2个5

1000ml1个6.5

500ml2个4

烧杯250ml1个3

100ml1个2

50ml2个2

塑料烧杯100ml/25ml各3个1.8

玻璃棒2支1

量筒10ml1支3.5

100ml1支5

干燥器160mm1台28

滴管5个1

溶解氧瓶250ml2个12

温度计1支2

磨口指示剂瓶50ml6个（棕色3个）2.5

广口瓶60ml32.5

250mL23.8

滴瓶30ml3个2

表面皿100mm2个3.5

漏斗90mm1只4.5

研钵90mm1个6

试管刷2个1

*匙双头2个3

定量滤纸φ7CM50盒/箱1盒13

洗耳球2个（一大一小）3

2、试剂

样品名称型号等级数量单价总价

EDTA25kg优级纯1瓶14

氢氧化钾（KOH）500g分析纯1瓶12

铬酸钾

浓氨水(NH3.H2O)500ml分析纯5

钙-羧酸指示剂ind25g指示剂1瓶45

甲基橙指示剂指示剂25g15

盐酸(HCl)500ml分析纯500ml

氢氧化钠500g分析纯3瓶7

浓硫酸(H2SO4)500ml分析纯2

无水碳酸钠500g分析纯2瓶11

碳酸钙500g分析纯1瓶12

草酸钠

氯化钠500g分析纯3瓶7

磷酸二氢钾(KH2PO4)分析纯1瓶15

过硫酸钾(KSO4)25kg/袋分析纯1瓶18

抗坏血酸25kgAR124

钼酸铵500g1瓶185

甲酸（HCOOH）500ml分析纯1瓶12

酒石酸锑钾500g1瓶48

无水乙醇500ml500ml1瓶8

三乙醇胺500ml分析纯1瓶18

氯化铵(NH4Cl)固体500g分析纯2瓶6

硝酸500mlAR(80%)17

硝酸银100gAR1325

高锰酸钾500g分析纯

可溶性淀粉AR500g分析纯1瓶18

酚酞分析纯

铬黑T指示剂100g分析纯100克/瓶8

合计

备注:橡胶手套一袋滤纸一盒蒸馏水:一桶PH试纸。

研钵大小规格

研钵,又称乳钵或*碾如果对我问题满意，请采纳，并五星评价